Biomedicines, 18/09/2025
Giới thiệu
Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell—MSC) mang lại triển vọng đầy hứa hẹn cho các phương pháp điều trị mới trong liệu pháp tế bào và sản xuất cơ quan nhân tạo, nhờ khả năng tự tái tạo và biệt hóa vượt trội thành nhiều loại tế bào chuyên biệt khác nhau. MSC có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm dây rốn, tủy xương, sụn, mô mỡ, nhau thai, tủy răng, và nhiều nguồn khác. Trong đó, nhau thai được xem là một nguồn đặc biệt quý giá để thu nhận MSC. Trong quá trình tái tạo sụn, tế bào sụn đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn cấu trúc và chức năng sinh học của mô sụn, bằng cách tổng hợp collagen và các thành phần của chất nền ngoại bào.
Phương pháp
Sau khi thu thập, mô nhau thai được cắt nhỏ và nghiền. Để phân lập MSC, mô được xử lý bằng enzyme theo hai phương pháp khác nhau, một là kết hợp trypsin với collagenase, và hai là chỉ sử dụng trypsin. Đối với quá trình cấy chuyền và tăng sinh MSC, nuôi cấy 2D trong flask T-75 được áp dụng với mật độ ban đầu là 5 × 10⁴ tế bào/cm², và tế bào được nuôi đến khi đạt độ phủ 80–90%. Mỗi 5–7 ngày, tế bào được phân tích các marker bề mặt. Sau đó, quá trình biệt hóa sụn của MSC được tiến hành trong điều kiện nuôi cấy 2D và 3D. Cuối cùng, tế bào sụn được nuôi cấy trên mô hình tĩnh và động với giá thể PLGA.
Kết quả
- Phân lập và khả năng bám dính của MSC
Tế bào MSC đã bám thành công lên đáy bình nuôi cấy trong vòng 48 giờ sau khi cấy và thể hiện hình thái đặc trưng của MSC. Không quan sát thấy hồng cầu còn sót lại hoặc mảnh vụn, cho thấy quá trình phân lập đạt hiệu quả. Cả hai quy trình: sử dụng Trypsin + Collagenase và chỉ Trypsin đều thu được MSC; tuy nhiên, sử dụng Trypsin + Collagenase thu được lượng tế bào cao hơn rõ rệt nhờ hoạt tính enzyme kết hợp, giúp mô tách rời hiệu quả hơn.
- Định danh
Phân tích bằng flow cytometry cho kết quả với mức biểu hiện cao của các marker CD73, CD90 và CD105, đồng thời hầu như không biểu hiện các marker tạo máu CD14, CD34, CD45 và HLA-DR. Điều này xác nhận độ tinh khiết và nguồn gốc trung mô của quần thể MSC để đảm bảo kiểu hình phù hợp cho quá trình biệt hóa sụn.
- Biệt hóa tế bào sụn trong môi trường 2D và 3D
Ở hệ thống nuôi cấy 2D, MSC đã biệt hóa thành công thành tế bào sụn sau 30 ngày. Ở hệ thống nuôi cấy 3D dạng pellet, nhuộm Alcian Blue sau 21 ngày, có sự lắng đọng glycosaminoglycan (GAG), cho thấy sự hình thành chất nền ngoại bào (ECM) giống mô sụn.
- Thời gian phân hủy của vật liệu sinh học PLGA
Các giá thể PLGA trong cả nuôi cấy tĩnh và động bắt đầu phân hủy từ ngày thứ 6 và gần như phân hủy hoàn toàn vào ngày thứ 9. Đặc biệt, các mẫu PLGA được nuôi trong PBS không có tế bào không bị phân hủy, cho thấy hoạt động tế bào và thành phần môi trường nuôi đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy polymer. Nhuộm Alcian Blue và Toluidine Blue chủ yếu bắt màu với các GAG sulfat và các phân tử ECM đặc hiệu cho sụn. Thành phần ECM được phát hiện sớm từ ngày thứ 6, nhưng quá trình lắng đọng ECM và tái cấu trúc giá thể diễn ra mạnh nhất ở các ngày sau đó và đạt mức tối ưu khoảng ngày thứ 21.
- Sự phân hủy vật liệu PLGA trong hệ thống RCCS
Hệ thống RCCS (Rotating Cell Culture System) cũng quan sát được quá trình phân hủy PLGA có động học tương tự, bắt đầu từ ngày thứ 6 và hoàn tất vào ngày thứ 9. Môi trường nuôi cấy động giúp tăng cường khuếch tán dinh dưỡng và tác động cơ học nên có thể đẩy nhanh quá trình phân hủy. Mặc dù giá thể bị phân rã, các tế bào vẫn duy trì cấu trúc 3D, bám vào các mảnh còn lại hoặc tạo thành khối kết tụ 3D.
- Đánh giá sự hình thành ECM trong mô sụn
Các mẫu sau 9 ngày nuôi trong RCCS được nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) và Toluidine Blue cho thấy các nhóm tế bào sụn đồng nguồn (isogenous groups) được bao quanh bởi ECM có sợi collagen rõ ràng, phù hợp với hình thái mô sụn. Quá trình biệt hóa sụn được khẳng định qua thay đổi hình thái tế bào, sự xuất hiện ECM đặc hiệu, và sự biểu hiện collagen loại II – marker đặc hiệu cho mô sụn.
- Sự phân hủy vật liệu sinh học trong nuôi cấy 3D
Các mẫu PLGA phân đoạn nuôi trong đĩa 6 giếng cho thấy bắt đầu phân hủy từ ngày thứ 6 và phân hủy hoàn toàn vào ngày thứ 9 trong môi trường có tế bào, trong khi các mẫu đối chứng trong PBS không bị phân hủy. Điều này chứng minh rằng chuyển hóa tế bào và thành phần môi trường đóng vai trò trong quá trình phân hủy PLGA. Ngược lại, các mẫu PLGA trong bioreactor RCCS-STLV chứa PBS không bị phân hủy trong 21 ngày, cho thấy điều kiện cơ học và thành phần môi trường đều ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy polymer.
Thảo luận
Nghiên cứu này đã phân lập thành công MSC bằng hai quy trình khác nhau, trong đó phương pháp kết hợp Trypsin–Collagenase cho hiệu suất cao hơn. Kết quả định danh cho thấy các MSC biểu hiện các marker đặc trưng (CD73, CD90, CD105). Mặc dù hoạt tính telomerase chưa được đánh giá, các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng MSC có nguồn gốc từ nhau thai thường có khả năng tăng sinh mạnh và có thể sở hữu telomere dài hơn so với MSC từ các nguồn mô khác. Nghiên cứu cũng xác nhận quá trình biệt hóa sụn của MSC thành tế bào sụn trong cả hệ thống nuôi cấy 2D và 3D, với sự thay đổi hình thái từ dạng hinh thoi giống nguyên bào sợi sang dạng tròn đặc trưng của tế bào sụn. Tuy nhiên, hiện tượng phân hủy nhanh bất ngờ của vật liệu sinh học PLGA trong cả điều kiện nuôi tĩnh và động 3D có thể ảnh hưởng đến độ bền cấu trúc của mô tạo thành. Ngoài ra, yếu tố tăng trưởng TGF-β1 được chứng minh có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình biệt hóa của MSC và sự hình thành mô sụn, thể hiện qua sự xuất hiện của các nhóm tế bào đồng sinh và sợi collagen trong chất nền ngoại bào. Hệ thống nuôi động trong thiết bị RCCS-4HD đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì kiểu hình tế bào sụn và hình thành chất nền ngoại bào, bất chấp những thách thức do sự phân hủy của PLGA. Đặc biệt, quá trình kết tụ 3D của các tế bào được xác nhận qua cấu trúc nhiều lớp được bao quanh bởi chất nền ngoại bào dày đặc, thể hiện sự sắp xếp không gian đặc trưng của mô ba chiều.
Kết luận
Nghiên cứu này nhấn mạnh tiềm năng của tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ nhau thai như một nguồn tế bào quý giá cho các ứng dụng trong y học tái tạo, đặc biệt là trong kỹ nghệ mô sụn. Sự kết hợp giữa các tế bào này với hệ thống nuôi cấy 3D và công nghệ bioreactor hứa hẹn mang lại hiệu quả cao hơn cho các chiến lược kỹ thuật mô. Để khai thác tối đa tiềm năng của các liệu pháp tái tạo mô sụn, các nghiên cứu tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa thành phần vật liệu sinh học, khảo sát các phác đồ yếu tố tăng trưởng khác nhau và điều chỉnh các thông số của bioreactor nhằm thúc đẩy quá trình phát triển mô.
Tài liệu tham khảo
Bài viết được dịch và tóm tắt từ bài báo (nếu có): Mujde, C., & Bisgin, A. (2025). Three-Dimensional Cartilage Tissue Engineering Using Placenta-Derived Extra-Embryonic Mesenchymal Stem Cells: From Isolation to Differentiation. Biomedicines, 13(9), 2291. https://doi.org/10.3390/biomedicines13092291
Nguồn: Biomedicines
